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自然杀伤（NK）细胞是一种独特的先天性淋巴细胞群体，具有识别和清除病毒感染细胞和肿瘤细胞的内在能力。NK细胞具有多种细胞毒性机制和通过细胞因子产生调节免疫反应的能力，在抗肿瘤免疫中发挥着关键作用。近二十年里，NK细胞作为免疫治疗剂在治疗晚期白血病患者中显示出安全性和有效性。在临床上，第一代NK细胞疗法取得了令人鼓舞的疗效和显著的安全性。近年来，随着嵌合抗原受体（CAR）工程过继性T细胞治疗的成功以及将细胞转化为强大抗肿瘤武器的技术进步，研究者们将NK细胞作为免疫治疗候选细胞的兴趣呈指数级增长。

2022年7月25日，美国得克萨斯大学安德森癌症中心的Katayoun Rezvani教授在国际知名期刊《nature reviews cancer》上发表了题为“Natural killer cells in antitumour adoptive cell immunotherapy” 的报道。该综述描述了增强NK细胞细胞毒性和寿命的各种方法，评估了免疫治疗的挑战和机遇；并从临床中吸取经验教训，思考了将如何指导下一代NK细胞产品的设计，以解决每种癌症的独特复杂性。

NK细胞以人类白细胞抗原（HLA）非限制性方式识别其靶点，使其成为普遍细胞免疫治疗的诱人候选。NK细胞效应器功能由一系列复杂的激活和抑制受体控制，这些受体可以区分健康细胞和“应激”细胞。受体-配体结合产生的累积线索决定NK细胞是否传递“杀伤”信号。健康细胞通过识别自身主要组织相容性复合体（MHC）I类分子而得以幸免，该类分子结合抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR），该受体发出停止NK细胞功能的信号。相反，NK细胞通过缺失自我识别的机制攻击异常的自我细胞，例如肿瘤细胞，肿瘤细胞下调MHC I类分子的表达，试图逃避T细胞反应，并上调由应激（如DNA损伤或恶性转化）诱导的激活配体。这些不同的属性为NK细胞提供了异基因治疗应用的独特优势。随着创新策略的加速发展和下一代技术的出现，可以进行更深入的生物学研究，可以设计各种NK细胞产品用于癌症治疗。

NK细胞的生物学特性

在固有免疫系统中，NK细胞是专门的免疫效应细胞，被怀疑在肿瘤免疫监测中发挥作用。NK细胞由骨髓中的CD34⁺祖细胞发育而来，但目前尚不清楚它们是来自一组独特的前体细胞，还是来自同时产生T淋巴细胞、B淋巴细胞和髓样细胞的多能祖细胞。与T细胞和NKT细胞不同，NK细胞缺乏克隆型TCR和负责信号转导的相关CD3复合物的表达。NK细胞通常根据表面蛋白CD56和CD16的相对表达分为两类：CD56^brightCD16^low/–和CD56^dimCD16⁺。然而，实际上NK细胞可能表现出更大的表型异质性，扩展到这两个亚群之外，从而产生具有不同功能特性的不同细胞群。

NK细胞具有很强的细胞毒性，在与靶点形成免疫突触后，通过释放细胞溶解颗粒和毒性细胞因子引发反应。此外，它们可以通过其FcγRIIIA (CD16)受体识别抗体包被的细胞，并触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和细胞因子的产生。NK细胞也被描述为“免疫调节”，因为它们能够产生一系列细胞因子和趋化因子，通过它们帮助形成B细胞和T细胞反应，并影响树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的功能。这种广泛的属性揭示了与NK细胞功能相关的生物机制的复杂网络，并支持NK细胞在免疫治疗中的价值。

NK细胞的记忆样功能

早期研究报告了NK细胞在巨细胞病毒感染的小鼠模型中的类似记忆反应，这种行为通常与先天免疫细胞无关。在这些研究中，小鼠NK细胞在用IL-12和IL-18的组合刺激时，获得了以IFNγ产生增加为特征的功能表型。有趣的是，在静止期后，这些细胞能够在细胞因子刺激或激活受体的参与下重新激活，并表现出增强的IFNγ反应，类似于适应性免疫细胞的记忆样特性。后来，用IL-12、IL-15和IL-18预激活的人类NK细胞，然后休息1-3 周，能够在随后的暴露下产生由增强的IFNγ产生驱动的强大反应细胞因子或K562白血病细胞。

NK细胞来源和供体选择

在癌症患者中，NK细胞通常表现出以基因表达谱改变和细胞毒性功能降低为标志的功能障碍表型，因此降低了自体NK细胞治疗应用的可行性。由于异基因NK细胞不会引起移植物抗宿主病（GvHD），目前的NK细胞治疗方案在很大程度上依赖于异基因来源，以避免与自体方法相关的潜伏期。NK细胞有多种来源，即外周血单个核细胞、脐血永生化细胞系、造血干细胞和祖细胞（HSPC）以及诱导多能干细胞（IPSC）。所有来源均可提供具有临床意义的细胞剂量，适用于CAR受体工程，并已在人体研究中转化。然而，它们具有独特的优势和挑战，并且可能具有不同的潜在转录、表型和功能特性。

鉴于其克隆生长和高扩增能力，以及体外分化能力，IPSC是NK细胞的一个有吸引力的来源，允许制造大量同质NK细胞产品。一个潜在的缺点是iPSC衍生的NK细胞通常表达低水平的内源性CD16，尽管这可以通过基因工程来缓解。另一个可能的担忧是IPSC可能含有与其起源的体细胞组织一致的DNA甲基化特征。这种“表观遗传记忆”可能会影响与供体细胞不同的特定细胞谱系的发育，因此在使用iPSC平台时应予以考虑。尽管如此，越来越多的基因工程iPSC NK细胞候选细胞正在临床前研究中出现，其中一些已经过渡到临床试验。在一项I/II期试验中，表达CAR的iPSC NK细胞在复发或难治（R/R）弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中显示出令人鼓舞的结果，无论是作为单药治疗还是与CD20靶向药物联合治疗。

原代NK细胞可以从外周血（PB-NK细胞）或脐血（CB-NK细胞）中获得。CB-NK细胞可以通过血库冷冻，而PB-NK细胞需要健康捐赠者的单采和捐赠者特异性采集。从所有这些来源获得的NK细胞在过继性细胞治疗应用中各有优缺点。源材料的各种选择赋予了治疗策略设计的多功能性，允许专门定制平台以满足每个患者群体的需求和疾病适应症。值得注意的是，供体间的变异性可能会影响NK细胞的分布，从而影响临床结果。

增强NK细胞适应性和抗肿瘤功能

1）嵌合抗原受体

嵌合抗原受体（CAR）是由细胞外抗原识别域和触发细胞激活的细胞内信号部分组成的合成融合蛋白。最常见的情况是，来自所需抗体的单链可变片段（scFv）用于抗原结合域，尽管还构建了许多包含天然细胞受体细胞外部分的CAR模式，利用受体-配体相互作用的自然特异性。CARs可以在免疫效应细胞上表达，以重新编程其对特定靶点的特异性。传统设计用于T细胞的CAR（包括CD3ζ和T细胞共刺激分子）已用于生成CAR-NK细胞，研究表明，这些细胞可以有效和特异性地靶向肿瘤，同时保持理想的安全性。CARs可能与NK细胞膜上的许多激活受体中的任何一种形成协同伙伴关系，从而导致协同激活。

2）NK细胞接合器

NK细胞也可以通过接合器定向到肿瘤部位，接合器通过触发NK细胞上的激活受体而引发强烈的NK细胞介导的抗肿瘤反应，同时将靶抗原结合到肿瘤细胞上。其他NK接合器策略包括三特异性和四特异性设计，旨在通过靶向肿瘤上的多种抗原或通过交联细胞因子部分来支持NK的扩增和存活来增强抗肿瘤作用。细胞接合器的使用绕过了工程的需要，不需要载体介导的基因转移，因此代表了一种更简单、成本更低的制造过程，可以提供能够诱导CAR样活性的产品。

3）细胞因子壳

尽管CAR工程技术寻求通过基因重定向其特异性来增强NK细胞功能，但也有一些倡议旨在体外和/或体内有效激发NK细胞，以维持最佳的抗肿瘤功能和持久性。众所周知，与已启动的NK细胞相比，新分离的NK细胞具有较低的细胞溶解能力。解决这一限制的一种方法是细胞因子介导的激活，目前正在研究各种方法。联合补充IL-2、IL-15和IL-21的NK细胞体外扩增表明，这些细胞因子增强细胞毒性功能，支持高增殖率，同时保持细胞处于健康、无衰竭状态。

4）克服免疫抑制

肿瘤微环境（TME）是一个严酷的代谢环境，其特征是免疫抑制代谢物、葡萄糖和氨基酸剥夺、缺氧和酸性的异质混合，这共同阻止了有效的抗肿瘤免疫。具体来说，在实体肿瘤中，低氧是免疫细胞功能障碍的常见驱动因素。已有研究表明，在低氧TME中，NK细胞功能受损，部分原因是抑制细胞，如TME中的髓源性抑制细胞（MDSC）、调节性T细胞（Treg细胞）和M2巨噬细胞的流入增加，以及低氧对NK细胞功能的直接影响。为了克服代谢免疫抑制的不利影响，目前的策略主要集中在两个方面：改变肿瘤的代谢组成或修改免疫细胞中的基因表达程序，以保护它们免受TME中抑制性代谢产物的影响。

5）检查点中断

肿瘤已经进化出复杂的机制来逃避免疫监视，包括免疫检查点的参与，这可能以与T细胞类似的方式抑制NK细胞。调节因子包括TIM3、具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体（TIGIT）和LAG3，其使用单克隆抗体的靶向性已被证明在体外逆转肿瘤诱导的NK功能障碍。抑制性KIR是NK细胞功能的有效负调节剂，当与HLA I类配体结合时，可以覆盖任何伴随的激活信号。与KIR分子相似，CD94/NK第2组成员A受体(NKG2A)是另一种显着的负性NK细胞调节剂，当与其同源配体HLA-E结合时，可抑制NK细胞的细胞毒性。

6）增强NK细胞向肿瘤的转运

NK细胞进入和穿透肿瘤床的能力是有效抗肿瘤免疫的关键先决条件，并与改善临床结果有关。与其他免疫细胞类似，NK细胞通过TME中分泌的趋化因子受体及其同源配体的动态相互作用被引导至肿瘤部位。近年来，越来越多的工作已经研究了如何利用这些相互作用的调节来增强对肿瘤的有效归巢。早期的研究侧重于扩增趋化因子受体，但由于内吞和降解导致趋化因子表达的迅速丧失。现在，越来越多地采用基因工程策略，以支持趋化因子受体调节，以增强NK细胞在多种难治肿瘤（包括多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、肾细胞癌、胰腺导管腺癌和卵巢癌）中向瘤床的转运。

CAR-T细胞治疗已取得显著的临床效果，这种新形式的细胞免疫治疗也显示出治疗各种癌症的潜力。在过去十年中，我们见证了NK细胞作为一种强大的新治疗候选者的出现，其生物学特性可能有助于克服基于T细胞的一些局限性。早期临床数据表明，NK细胞非常适合用于异基因治疗环境。到目前为止，在正在进行的临床研究中尚未报告任何重大不良事件。尽管安全性结果令人鼓舞，但仍需进一步研究，以阐明异基因NK细胞是否能够避免受体T细胞的长期排斥反应。